Quins són els passos del Western Blotting?

Western blotting és una tècnica de detecció de proteïnes inventada per primera vegada pel nord-americà George Stark. Utilitza la tecnologia d'electroforesi per separar proteïnes de teixits o cèl·lules específiques, fixar-les a membranes NC o membranes PVDF i després utilitza anticossos específics per detectar antígens específics. Com que aquesta tecnologia pot trobar antígens que causen malalties, ara s'ha utilitzat àmpliament en molts camps biològics com el diagnòstic de malalties. Vegem els passos per fer els peus de porc.

1. Principi

És similar als mètodes d'hibridació Southern Blot o Northern Blot, però Western Blot utilitza electroforesi en gel de poliacrilamida, l'objecte a detectar és la proteïna, la "sonda" és l'anticossos i el "desenvolupament" és un anticòs secundari marcat. La mostra de proteïna separada per PAGE (electroforesi en gel de poliacrilamida) es transfereix a un transportador en fase sòlida (com la membrana de nitrocel·lulosa). El transportador en fase sòlida adsorbeix la proteïna en forma d'enllaços no covalents i pot mantenir el tipus de polipèptid separat per electroforesi i la seva activitat biològica. La proteïna o el polipèptid del portador en fase sòlida s'utilitza com a antigen, que reacciona amb l'anticòs corresponent, i després reacciona amb el segon anticòs marcat amb un enzim o isòtop, i es detecta mitjançant el desenvolupament del color del substrat o la radioautografia.

2. Classificació

Hi ha diversos mètodes principals per al desenvolupament de Western Blot:

i. Autorradiografia

ii ECL de quimioluminescència del substrat

iii. ECF de fluorescència

iv. Desenvolupament del color del substrat DAB

Els mètodes utilitzats habitualment són l'ECL de quimioluminescència del substrat i la colorimetria DAB del substrat. Tot el que heu de fer és comprar un kit de prova ja fet, i el funcionament és relativament senzill (l'anticòs secundari està etiquetat amb HRP): el substrat de reacció és peròxid + luminol, emetrà llum, que pot exposar la pel·lícula i rentar les bandes. Mesura els components proteics expressats per gens diana específics separats per electroforesi. Aquesta tècnica també s'utilitza àmpliament per detectar nivells de proteïnes.

3. Preparació de la mostra

1. Extracció de proteïnes totals de cèl·lules monocapa adherides:

2. Extracció de proteïnes totals dels teixits:

3. Extracció de proteïnes totals de cèl·lules adherents tractades amb fàrmac.

Western blotting, un mètode per identificar malalties causades per gens mal expressats. Aquest avantatge de poder trobar ràpidament l'antigen que causa la malaltia i tenir l'anticòs específic (una proteïna) tacat s'utilitza àmpliament en l'estudi de malalties genètiques, problemes genètics i detecció de malalties. A partir de la seva producció, també s'estan desenvolupant noves tecnologies de detecció, com el mètode d'hibridació Southern Blot.