Quins són els mètodes per extreure proteïnes?

Com tots sabem, les proteïnes són indispensables per a les activitats de la vida humana. Molts aliments contenen proteïnes, i una dieta normal pot complementar les proteïnes del cos. De fet, en el camp de la investigació bioquímica, la tecnologia de separació i extracció de proteïnes té un ampli ventall d'aplicacions. No és fàcil extreure proteïnes, requereix molts processos i tècniques operatives professionals.

1. Ultracentrifugació

El principi d'aquest mètode per separar i purificar antígens és utilitzar les diferents velocitats de sedimentació de cada partícula a la solució de gradient de manera que les partícules amb diferents velocitats de sedimentació es trobin en diferents capes de gradient de densitat per aconseguir el propòsit de separar-se les unes de les altres. Els mitjans de gradient de densitat utilitzats habitualment inclouen sacarosa, glicerol, CsCl, etc.

Quan es separen i es depuren antígens mitjançant ultracentrifugació o centrifugació de densitat de gradient, és extremadament difícil separar un determinat component d'antigen, excepte per a components individuals, per tant, només s'utilitza per separar uns quants antígens moleculars grans, com ara IgM, C1q, tiroglobulina, etc., i algunes substàncies antigens més lleugeres com l'apolipoproteïna A, B, etc. La majoria de proteïnes de pes molecular mitjà i petit són difícils de purificar mitjançant aquest mètode.

2. Mètode de precipitació selectiva

El principi és utilitzar diversos precipitants o canviar determinades condicions per induir la precipitació dels components de l'antigen proteic en funció de les diferències en les propietats físiques i químiques de cada proteïna, aconseguint així el propòsit de purificació. El mètode més utilitzat és la depuració de les precipitacions.

Principi del mètode de salaó

La solubilitat de la proteïna en solució aquosa depèn del nombre de molècules d'aigua al voltant dels ions superficials de les molècules de proteïnes, és a dir, està determinada principalment pel grau en què els grups hidròfils a la perifèria de les molècules de proteïnes formen una pel·lícula d'hidratació amb aigua i la càrrega de les molècules de proteïnes. Després d'afegir sal neutra a la solució de proteïnes, la capa d'hidratació al voltant de les molècules de proteïnes es debilita o fins i tot desapareix perquè l'afinitat de la sal neutra per les molècules d'aigua és més gran que la de les proteïnes. Al mateix temps, quan s'afegeix sal neutra a la solució de proteïnes, la força iònica canvia i la càrrega a la superfície de la proteïna es neutralitza en gran mesura, la qual cosa redueix encara més la solubilitat de la proteïna i fa que les molècules de proteïnes s'agreguin i precipitin. Com que diverses proteïnes tenen una solubilitat diferent en diferents concentracions de sal, les solucions salines de diferents saturacions precipiten diferents proteïnes, separant-les així d'altres proteïnes. La solució de sal més utilitzada és el sulfat d'amoni amb una saturació del 33% al 50%. El mètode d'extracció de sal és senzill i convenient i es pot utilitzar per a l'extracció bruta d'antígens proteics, extracció d'immunoglobulina G, concentració de proteïnes, etc. La puresa dels antígens purificats pel mètode de salting no és alta i només és adequada per a la purificació preliminar d'antígens.

3. Cromatografia en gel

La cromatografia en gel utilitza el tamisatge molecular per separar les proteïnes. El gel és una substància amb una estructura de xarxa porosa tridimensional. Després de l'equilibri adequat de la solució, es carrega a la columna de cromatografia. Quan una solució de mostra que conté diverses molècules flueix lentament a través d'una columna de cromatografia en gel, les substàncies macromoleculars no poden entrar fàcilment als micropors de les partícules de gel i només es poden distribuir entre les partícules, per tant, es mouen cap avall més ràpidament durant l'elució i s'elueixen primer. A més de difondre's en els buits entre les partícules de gel, les molècules petites també poden entrar als microporus de les partícules de gel, moure's cap avall més lentament durant l'elució i, posteriorment, s'eluiten. Per tant, les molècules de proteïnes es separen segons la seva mida molecular.

4. Cromatografia d'intercanvi iònic

El principi de la cromatografia d'intercanvi iònic és utilitzar alguna cel·lulosa o gel amb grups iònics per adsorbir i intercanviar antígens proteics amb càrregues oposades. Com que diverses proteïnes tenen diferents punts isoelèctrics i porten diferents quantitats de càrrega, les seves capacitats per unir-se a la cel·lulosa (o gel) varien. Durant l'elució en gradient, la força iònica de la fase mòbil augmenta gradualment, de manera que els ions afegits competeixen amb les proteïnes per les posicions de càrrega a la cel·lulosa, dissociant així les proteïnes adsorbides de l'intercanviador d'ions.

Els següents intercanviadors d'ions s'utilitzen habitualment en la tecnologia de cromatografia d'intercanvi iònic:

① Cel·lulosa amb grups d'intercanvi iònic, com ara cel·lulosa carboximetil (CM), cel·lulosa DEAE

② Dextran, agarosa i poliacrilamida reticulats amb grups d'intercanvi iònic

③Resina altament reticulada sintetitzada per gel.

5. Cromatografia d'afinitat

La cromatografia d'afinitat és una tècnica de cromatografia dissenyada per utilitzar la bioespecificitat de les biomacromolècules, és a dir, l'afinitat específica entre les biomacromolècules. Per exemple, hi ha una afinitat especial entre antígens i anticossos, enzims i inhibidors enzimàtics (o lligands), proteïnes i coenzims enzimàtics, hormones i receptors, IgG i proteïna estafilocòcica A (SPA). Per exemple, quan es purifica IgG, SPA es pot adsorbir en una matriu de fase sòlida inert (com Spehrose 2B, 4B, 6B, etc.) i es pot preparar en una columna de cromatografia. Quan la mostra flueix a través de la columna de cromatografia, la IgG a separar es pot unir específicament a l'SPA, mentre que la resta de components no s'hi poden unir. Després d'eluir completament la columna de cromatografia, es canvia la força iònica o el valor de pH de l'eluent per dissociar la IgG de l'SPA a la matriu de fase sòlida i la IgG a purificar es pot obtenir recollint l'eluent.